Bradford assay 단백질 정량 실험 101 브래드포드 어쎄이

Bradford assay 정확히 말하자면, Bradford Coomassie Brilliant Blue assay로, Marion Mckinley Bradford에 의해 발명되었다.

단백질에 흡광도를 갖는 염색물질인 Coomassie Brilliant Blue G-250 를 붙여 microspectroscopy로 흡광도와 단백질 농도의 상관관계로 (Beer's law, 흡광도 = 물질별상수*농도*빛 투과 길이) 단백질 정량을 하는 방식이다.

BSA(bovineserum albumin, 소혈청알부민)의 농도를 표준으로 잡고 샘플내 단백질의 양을 상대적으로 구하는 방법이다.

    

Coomassie Brilliant Blue G-250 화학구조와 스테이닝 후 색변화

 [출처:photo by L. Frasson, instagram@samyrmachdo & wikipedia.org/wiki/Coomassie_Brilliant_Blue]

 

기본적으로 방향족고리가 많기 때문에 단백질의 소수성 잔기에 쉽게 반데르발스힘 (van der waals interaction)에 의해 붙게 된다. 이온성을 띄는 아민(N⁺) 그룹이나 산화황 이온(SO₃^- )에 의한 작용도 이 화학물질이 단백질에 잘 흡착 될수 있는 이유이다.

 

Coomassie Blue를 단백질과 결합시켜 주고 나면 보통 590nm 의 빛의 흡광도를 측정하는데, BSA를 이용한 표준곡선을 그리면 항상 R square 값이 0.8 이하로 좋지 않다.

가끔 고온 고압으로 멸균한 파이펫 팁의 코팅이 벗겨 지는지 잔여물들이 남을때가 있다. 이런 에러도 팁끝에 묻어 있는 방울방울에 그에러가 기인되어진다 생각했는데, 96년도에 나온 논문을 보니 단백질 자체가 가지고 있는 흡광도 때문이라설명하고 있다.

 

Tsaffrir Zor and Zvi Selinger, 

"Linearization of the Bradford Protein Assay Increases Its Sensitivity: Theoretical and Experimental Studies" 

ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 236, 302–308 (1996)

 

학부때 부터 무작정 따라 하던 실험의 기본이 무엇에 근거 하고 있었는지 이제서야 살펴 보게 되었다.

 

Coomassie Blue는 3개의 charge form을 가지며, 이 염색물질의 흡광도는 470nm 590nm 650nm에서 뚜렷해진다. 

590nm 파장을 흡수하는 (파란색) 형태의 구조가 단백질에 쉽게 붙는 형태로, 

dye가 단백질에 붙을 수록 빨간색을 띄는 450nm 파장대 빛의 흡광도(free dye의 양이 줄어 들기 때문에)가 상대 적으로 낮아 지게 된다.

 

결국 dye가 단백질에 붙는 흡광도 뿐만 아니라, dye 자체의 흡광도의 영향 때문에 590nm에서의 흡광도 측정은 부정확하다는 말이라는 것 같다.

 

결론은 간단하다

 

흡광도@590nm/흡광도@450nm 의 비율로 구하면 정확한 직선 관계식이 나오게 된다. 

 (필자는 이방법으로 R² 값이 0.999가 나온다.)

 

실험실에 신입생이건 인턴이건 실험을 처음 시작하는 친구들이 브래드포드 할일 있으면 이논문 던져 준다.

 

A. 590nm에서만 측정했을때, B. 590nm와 450nm에서 측정한 흡광도 비율로 그래프를 그렸을때의 BSA 표준 곡선 

 [Analytical Biochemistry, 1996, 236, 302–308]